一、成果引入：当"钓靶"遇上"高通量"
药物靶点发现是创新药研发的"第一公里"。传统的化学蛋白质组学方法——尤其是基于活性的蛋白质组分析（ABPP）——虽能在天然生物体系中无偏倚地评估小分子-蛋白相互作用，但存在一个根本性瓶颈：只能对预先合成的化合物逐个筛选，通量低、化学合成负担大。
这就好比你想在一座图书馆里找到特定的一本书，但每次只能看一本书的封面——效率之低不言而喻。
深圳湾实验室李刚课题组在 *Nature Communications* 上发表的研究，通过将动态组合化学（DCC）与ABPP创造性融合，建立了"分子库对蛋白质组"（library-versus-proteome）高通量筛选平台，将筛选通量提升10-20倍，并颠覆性地提出"先筛选、后合成"的研究范式。
这篇文章构建了一个从方法创新→靶点发现→功能验证→先导优化→体内药效的"完整证据闭环"：
·🔬 8次质谱分析 → 80种候选分子 → 2627个可配体化半胱氨酸位点的EC50图谱
·🎯 发现PPME1、ABHD11、PNPLA6、NIT2、PRDX5、VCP等多个蛋白的选择性共价抑制剂
·💊 VCP抑制剂compound 95 → 纳摩尔级活性 → 体内显著抑制肿瘤生长
与武汉研锦生物的关联：本研究的核心技术——ABPP（基于活性的蛋白质组分析）、TMT定量蛋白质组学、竞争型ABPP——正是研锦生物标记法药物钓靶服务的核心支柱。李刚课题组的"先筛选、后合成"策略为药企客户提供了一种全新的靶点发现思路：先在全蛋白质组层面锁定高价值靶标，再精准合成验证——这正是研锦"钓靶→验证→优化"一体化服务链中"钓靶"环节的前沿方法论参照。
*图1 | DCL-ABPP"库对蛋白质组"筛选与传统ABPP单化合物筛选范式对比。左侧：传统方法需预先合成纯化合物库，逐一进行竞争型ABPP验证；右侧：DCL-ABPP通过动态组合化学在原位生成分子库，与全蛋白质组同时竞争筛选，仅对命中分子进行后续合成，实现"先筛选、后合成"的范式转换。*
二、分步拆解：从"逐一筛选"到"库对库"的五步技术链条
模块一：动态组合化学建库（DCL）—— 化繁为简的化学智慧
原理：动态组合化学（Dynamic Combinatorial Chemistry, DCC）利用可逆化学反应（如亚胺键、二硫键、酰腙键等），使不同分子片段在体系中动态交换和重组，自发形成热力学稳定的化合物组合。当体系中存在蛋白质"模板"时，能够与蛋白结合的分子会被优先富集——这就是模板驱动的配体筛选原理。
实验设计：
·第一代策略：设计能与醛片段发生可逆反应的亲电warhead骨架
·与片段醛库原位构建动态分子库
·通过丝氨酸水解酶家族探针（fluorophosphonate探针）竞争实现全蛋白质组范围筛选
为什么这样做：传统ABPP需要对每个候选化合物单独合成、纯化、然后逐一竞争筛选。而DCL策略的关键优势在于——分子库是在筛选体系中"现场生成"的，省去了大量前期合成工作。同时，蛋白质模板的存在天然地引导化学平衡向高亲和力配体方向移动。
数据与结论：
·成功发现PPME1、ABHD11和PNPLA6等丝氨酸水解酶的选择性共价抑制剂
·PNPLA6特异性抑制剂为首次报道——此前该蛋白缺乏已知选择性化学探针
·借助该抑制剂，结合脂质组学分析，系统拓展了PNPLA6的内源性底物谱：不仅水解LPC，还作用于LPE、LPI等多种溶血磷脂
·功能性验证揭示PNPLA6参与癌细胞增殖调控
模块二：半胱氨酸靶向拓展（2nd Gen DCL-ABPP）—— 从家族靶向到残基级精度
原理：在丝氨酸水解酶验证成功的基础上，课题组将平台拓展到更广泛的半胱氨酸（Cys）残基靶向。关键创新在于——设计了同时带有反应基团和炔基标签的双功能DCL成员。这样的分子与半胱氨酸共价结合后，可直接通过点击化学（CuAAC）富集并由质谱解析修饰位点。
实验设计：
·DCL成员：含有丙烯酰胺warhead + 炔基标签
·竞争型ABPP设计：用广谱半胱氨酸探针（IA-rhodamine）作为读出
·TMT 10-plex标记定量蛋白质组学：仅8次质谱分析完成80种候选分子同时筛选
为什么这样做：传统竞争型ABPP难以在大规模位点层面解析复杂混合物中每个配体的独立活性。第二代策略的创新在于——通过炔基标签直接"抓取"被修饰的半胱氨酸位点，同时利用半胱氨酸修饰后的偏移分子量，直接在质谱中解析有效分子的结构信息。相比第一代，省去了确认有效配体的凝胶分析环节。
数据与结论：
·获得了2627个"可配体化"半胱氨酸位点及其表观EC50数据
·建立了大规模半胱氨酸共价配体图谱
·发现NIT2、PRDX5、TXNDC17、RPS6KA1和VCP等多个蛋白的选择性共价配体
·多数靶蛋白此前缺乏已知抑制剂
模块三：功能验证—— 从"结合"到"功能"的因果闭环
原理：发现配体只是第一步，验证配体能否调控靶蛋白功能才是关键。课题组选取多个代表性配体进行深度功能验证，确保筛选结果具备"功能探针"价值。
实验设计：
·靶点验证：竞争型ABPP确认配体在蛋白裂解液和活细胞中对靶蛋白的特异性标记
·酶活检测：纯化蛋白体外的酶活抑制实验
·细胞功能：PRDX5配体处理后监测线粒体中过氧化氢代谢变化
为什么这样做：化学蛋白质组学筛选容易产生假阳性——一个分子可能与蛋白结合但不影响其功能。只有通过正交验证（酶活+细胞功能），才能从"结合事件"推进到"功能事件"，完成靶点发现的因果闭环。
数据与结论：
·PRDX5配体：显著影响线粒体中过氧化氢代谢，证明平台筛选的分子具有良好的功能探针潜力
·各配体均能特异性标记对应靶蛋白的关键功能位点
·多个配体在细胞层面展示出表型调控能力
模块四：VCP靶点的深度解析 —— 从靶点到通路到机制
原理：在众多候选靶点中，课题组聚焦VCP（Valosin-Containing Protein）——一种在蛋白质稳态调控中至关重要的AAA+ ATP酶，作为深度机制研究的模型靶标。
实验设计：
·靶点确认：G2-369（筛选获得的半胱氨酸靶向配体）与VCP的结合验证
·酶活抑制：ATP酶活性检测
·通路解析：BONCAT新生蛋白质组学分析
·机制挖掘：ER stress-UPR通路标志物检测 + GPCR信号交叉分析
为什么这样做：VCP是细胞内蛋白质质量控制系统（ERAD途径）的核心组分，但其调控机制尚不完全清楚。利用高选择性化学探针扰动VCP功能、结合新生蛋白质组学捕获下游响应，是一种比传统遗传学手段（siRNA/CRISPR）更快速、更接近药理干预模式的通路解析策略。
数据与结论：
·G2-369高效结合VCP并抑制其ATP酶活性，在癌细胞中诱导明显细胞毒性
·VCP C522位点抑制 → 激活内质网应激-未折叠蛋白反应（ER stress-UPR）
·新发现：GPCR信号与ER应激之间存在此前未被报道的串扰机制
·GNG4蛋白参与调控PERK和ATF4信号激活
·揭示VCP介导的细胞死亡不仅依赖经典应激轴，也与GPCR/ERK信号分支密切相关
模块五：先导化合物优化—— 从"命中"到"药物候选"的快速迭代
原理：在获得先导分子G2-369后，课题组展示了一个令人印象深刻的案例：如何利用同一平台快速优化先导化合物。这是DCL-ABPP区别于传统方法的最大亮点之一——筛选平台本身即可用于先导优化。
实验设计：
·以G2-369为竞争探针的凝胶快速竞争型DCL-ABPP
·筛选范围：403种商业醛片段 × 2种warhead = 806个理论候选分子
·时间：仅2天完成全部筛选
·获得更高活性VCP抑制剂 compound 95
体内验证：
·纯化VCP蛋白：纳摩尔级酶活抑制
·裂解液和活细胞：优于G2-369的抑制效果
·HT29和AMO1肿瘤细胞：抗增殖活性显著增强，部分细胞IC50低至78.9 nM
·HT29结直肠癌皮下移植瘤小鼠模型：5 mg/kg腹腔注射，每周3次，持续21天 → 显著抑制肿瘤生长
为什么这样做：传统先导优化是一个"设计→合成→测试→再设计"的漫长迭代过程。DCL-ABPP平台将这一过程压缩为"库生成→竞争筛选→命中鉴定"的快速循环，大幅降低合成负担，将先导优化从"月级"压缩到"天级"。