CETSA 技术平台

武汉研锦生物（YanGeneBio）是一家专注于药物靶点发现与药物机制验证的创新型生物技术服务公司，为新药研发、中药现代化及天然产物研究提供从靶点发现到机制验证的解决方案。我们整合ABPP、TPP、Lip-MS等药物钓靶技术，交联质谱、Lip-MS+分子对接鉴定药靶互作位点技术，SPR/MST/BLI/ITC/DSF检测药靶亲和力平台，蛋白芯片、Olink 多因子等高通量筛选检测平台，小核酸药物合成与类器官筛药等核心技术，为客户提供高精度的化合物靶点鉴定、结合位点分析、亲和力验证及功能验证服务。 摘要：在活细胞生理环境下直接验证药物与靶点的特异性结合，是药物研发从体外筛选走向临床转化的关键环节。细胞热位移分析技术（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）突破传统分子互作技术依赖纯化蛋白、脱离生理环境的局限，实现活细胞及组织内靶点蛋白-配体相互作用的直接、原位、定量检测。本文系统阐述CETSA技术原理、标准化实验流程、数据分析方法，结合对比数据论证其核心优势，通过典型应用案例展示技术价值，并梳理服务优势与覆盖实验类型，为创新药物研发、靶点发现与机制研究提供前沿技术参考。 CETSA技术原理 CETSA技术基于配体结合改变蛋白质热稳定性的核心原理，实现活细胞内靶点蛋白-配体相互作用的直接检测。蛋白质在生理温度下维持天然构象，当温度升高时会发生热变性、聚集并沉淀；而当靶点蛋白与特异性配体（药物、小分子、多肽等）结合后，其构象稳定性显著提升，热变性温度（Tm）向高温方向偏移。技术通过梯度加热处理细胞/组织样本，使未结合配体的靶点蛋白发生热变性沉淀，而结合配体的靶点蛋白保持可溶性；随后通过离心分离可溶性蛋白与变性沉淀，利用Western Blot、质谱或荧光定量等方法检测可溶性靶点蛋白的含量，绘制热位移曲线（Melting Curve），计算Tm值偏移量（ΔTm），从而定量评估配体与靶点在活细胞内的结合亲和力与特异性。CETSA分为两种核心模式：经典CETSA（基于Western Blot/质谱检测，适用于已知靶点）与MS-CETSA（基于质谱的全蛋白质组检测，适用于未知靶点筛选与脱靶效应分析），可在活细胞、组织切片甚至活体动物体内实现靶点结合的原位验证，最大程度保留生理微环境，真实反映药物在体内的作用机制。 CETSA标准化实验流程 （一）样品处理与药物处理1.细胞培养：将目标细胞接种于培养皿，培养至对数生长期，设置药物处理组与对照组（DMSO溶剂对照），药物浓度覆盖预期EC50的1-100倍； 2.组织样本：取动物组织或临床穿刺组织，剪碎后匀浆，加入药物孵育，模拟体内药物作用环境； 3.孵育条件：37℃孵育1-4小时，确保药物充分穿透细胞膜并与靶点结合，模拟生理条件下的药物-靶点相互作用。 （二）梯度加热与蛋白分离 4.梯度加热：将处理后的细胞/组织样本分装至PCR管，设置梯度温度（通常37℃-80℃，间隔3-5℃），恒温加热3-5分钟，使蛋白发生热变性； 5.快速裂解与离心：加热后立即冰浴冷却，加入细胞裂解液，反复冻融裂解细胞；随后高速离心（16000g，20分钟），分离上清液（可溶性蛋白）与沉淀（变性蛋白）； 6.蛋白定量：采用BCA法测定上清液中总蛋白浓度，保证上样量均一。 （三）靶点蛋白检测7.经典CETSA：采用Western Blot检测上清液中靶点蛋白的表达量，以GAPDH/β-actin为内参，定量分析不同温度下可溶性靶点蛋白的含量； 8.MS-CETSA：将上清液进行酶解、标记，通过高分辨质谱进行全蛋白质组检测，无偏向性筛选所有发生热位移的蛋白，实现靶点与脱靶蛋白的全局分析。 （四）数据分析9.热位移曲线绘制：将可溶性蛋白相对含量对温度作图，得到热位移曲线，通过非线性拟合计算Tm值； 10.结合效应评估：比较药物处理组与对照组的Tm值，ΔTm>2℃即判定为特异性结合，ΔTm越大表示结合亲和力越强； 11.浓度依赖性验证：设置不同药物浓度，检测Tm值随浓度的变化，验证结合的特异性与饱和性，计算EC50值。 核心优势总结： 12.生理原位检测：直接在活细胞、组织内检测，保留细胞膜、细胞器及蛋白复合物等生理微环境，真实反映药物在体内的结合行为； 13.无需蛋白纯化：突破传统技术依赖纯化蛋白的瓶颈，适用于膜蛋白、难纯化蛋白、核蛋白等复杂靶点的验证； 14.全局靶点筛选：MS-CETSA可实现全蛋白质组无偏向性筛选，同时鉴定靶点与脱靶蛋白，降低药物研发风险； 15.特异性强：通过热位移与浓度依赖性双重验证，有效排除假阳性结果，精准区分特异性结合与非特异性作用。 典型应用案例 （一）抗肿瘤药物靶点验证在靶向KRASG12C的小分子药物研发中，采用CETSA技术验证药物与靶点的细胞内结合。将KRASG12C突变型肺癌细胞经药物处理后，梯度加热检测可溶性KRAS蛋白含量，结果显示药物处理组Tm值较对照组提升6.8℃，且呈现浓度依赖性，EC50=125nM，明确药物在活细胞内特异性结合KRASG12C靶点，为临床前研究提供关键证据。 （二）天然产物靶点发现采用MS-CETSA技术筛选中药活性成分黄芩苷的潜在靶点，对肝癌细胞进行药物处理与全蛋白质组热位移分析，共鉴定出18个发生热位移的蛋白，其中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK14）的Tm值提升5.2℃，验证黄芩苷通过靶向MAPK14抑制肿瘤增殖，为中药现代化研究提供全新靶点发现策略。 （三）药物脱靶效应评估在激酶抑制剂研发中，利用MS-CETSA检测药物在细胞内的脱靶蛋白，发现除预期靶点外，药物还结合3个非特异性激酶，通过结构优化降低脱靶结合后，脱靶蛋白的热位移效应消失，有效提升药物安全性，缩短临床前安全性评价周期。 （四）临床样本靶点占有率检测采用CETSA技术检测肿瘤患者穿刺组织中药物的靶点占有率，结果显示给药后患者肿瘤组织中靶点蛋白的Tm值显著提升，且靶点占有率与临床疗效正相关，为临床个体化用药与疗效评估提供无创检测指标。 CETSA服务优势与覆盖实验类型 （一）服务优势 16.全流程标准化：建立从细胞培养、药物处理到检测分析的标准化SOP，严格质控，保证实验重复性与数据可靠性； 17.双模式定制化：提供经典CETSA（已知靶点验证）与MS-CETSA（未知靶点筛选）双技术方案，适配不同研发阶段需求； 18.多维度数据分析：除Tm值、ΔTm外，同步提供浓度依赖性曲线、靶点占有率、脱靶蛋白分析等多维度数据； 19.快速交付：经典CETSA 3-5个工作日交付报告，MS-CETSA 7-10个工作日交付，加急服务可缩短至2-3天。 （二）覆盖实验类型20.已知靶点验证：小分子/抗体/多肽与细胞内靶点的特异性结合验证； 21.未知靶点发现：MS-CETSA全蛋白质组筛选天然产物/药物的潜在靶点； 22.脱靶效应评估：全局分析药物的非特异性结合蛋白，评估安全性； 23.临床样本检测：穿刺组织/血液样本中药物靶点占有率检测； 24.药物构效关系：分析不同衍生物的靶点结合能力，指导药物优化。 结论与展望 细胞热位移分析技术（CETSA）以其生理原位、无需纯化、全局筛选等核心优势，彻底改变了传统药物靶点验证依赖体外实验的模式，成为连接体外筛选与体内验证的关键桥梁。从靶点发现、药物验证到临床转化，CETSA技术提供真实、精准的细胞内互作数据，大幅降低药物研发失败率，加速创新药物上市进程。随着技术的不断迭代，CETSA与单细胞测序、空间转录组学的深度融合，将实现单细胞水平靶点结合的空间分布分析；同时，活体CETSA技术的发展，将实现动物体内药物-靶点互作的实时动态检测，为精准医学与个体化治疗提供更强大的技术支撑，引领药物研发进入活细胞靶点验证的新时代。